ВЕСТЕРН-БЛОТИНГ ИЛИ ИММУНОБЛОТИНГ
Вестерн-блотинг, иммуноблотинг - современный высокочувствительный метод идентификации белков, в том числе вирусных антигенов.
Метод основан на комбинации гель-электрофореза и реакции антиген-антитело. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико- и липопротеинов и максимальной специфичностью детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител.
В оптимально отработанных условиях иммуноблотингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме. Технически иммуноблотинг выполняется в три приема:
1) подлежащие анализу белки подвергаются разделению в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих веществ: додецилсульфата натрия или мочевины, этот процесс часто обозначают как SDS-PAGE; разделенные белки могут визуализироваться после окрашивания и сравниваться с эталонными образцами;
2) разделенные белки переносятся с геля путем наложения (блотинга) на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируются на нем; во многих случаях, но не всегда, при переносе сохраняются количественные соотношения белков;
3) на фильтры наносятся детектирующие поли- или моноклональные антитела, содержащие радиоизотопную или ферментную метку; для обнаружения связавшихся антител применяют также антивидовую меченую сыворотку, иными словами, на заключительном этане блотинг аналогичен твердофазным иммунологическим тестам.
Следует иметь в виду, что в данной постановке иммуноблотинга белки находятся в денатурированном состоянии, и поэтому могут не распознаваться антителами, специфическими по отношению к нативному белку, но зато при наличии сывороток ко всем составляющим пептидам одновременно выявляется весь антигенный спектр испытуемого белка.
Иммуноблотинг достаточно широко используется в исследованиях строения вирусов гепатитов, в частности, для установления антигенного родства между отдельными штаммами. Высокая разрешающая способность иммуноблотинга позволяет получать хорошие результаты и в диагностической практике, когда требуется идентифицировать вирус в тканях или экскретах больного.
Western blotting or immunoblotting